od cells in peripheral blood，WBC-CL)、脾细胞抗体生成细胞数(或称空斑形成细胞，plaque formating cell，PFC)、迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)以及天然杀伤细胞(natural killer，NK)活性等非特异、体液或细胞免疫的代表性指标，观察小鼠免疫功能在4周内的动态变化规律；同时研究绿茶(green tea，GT)、复合茶(mixed tea，MT)和茶多酚(tea polyphenol，TP)对NNK所致小鼠免疫功能改变的调节作用，进一步为阐明茶叶防癌与免疫调节的关系提供实验依据。材料与方法

　　一、材料

　　雌性昆明种小鼠，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心；NNK购自Chemsyn Science Lab(纯度>98%)；51Cr购自Amersham公司；YAC-1细胞由北京劳动卫生研究所赠送；GT(杭州炒青)、MT(绿茶提取物+茶多酚+茶色素)和TP(40%纯度)由中国农业科学院茶叶科学研究所提供；发光增强剂鲁米诺购自Sigma公司；酵母多糖购自上海第二军医大学放射医学教研室；鸡红细胞用健康雄性成年来杭公鸡血制备；绵羊红细胞用健康成年绵羊血制备；豚鼠血清由中国预防医学科学院环境卫生监测所毒理室提供；1640培养基为Gibco公司产品；其余为市售分析纯或优级纯试剂。

　　二、动物分组

　　实验动物随机分为正常对照(NC)、NNK对照(NNK-C)、1.0% GT+NNK(NNK+GT)、0.5% MT+NNK(NNK+MT)和0.5% TP+NNK(NNK+TP)5组，每组按不同处死时间又分为若干小组，每小组6只动物左右。

　　三、NNK配制及注射

　　按500 μmol/kg剂量称取NNK，加入1～2滴二甲基亚砜(终浓度<2‰)将NNK完全溶解，用生理盐水稀释后，过滤除菌，单次腹腔注射小鼠(每只0.5 ml)。

　　四、茶水、复合茶和茶多酚的配制

　　绿茶用沸水浸泡两次(每次20～30 min)，合并两次浸出液配成浓度1.0%的茶水；复合茶和茶多酚用凉开水配成0.5%的溶液；从注射NNK前7天起供小鼠自由饮用；每日更换新鲜茶水、复合茶或茶多酚水溶液，并记录动物饮水量，直至处死。NC和NNK组饮凉开水。

　　五、观察指标

　　1.用体内YAC-1细胞清除试验测量小鼠NK活性［8］：将处于指数生长期的YAC-1细胞用51Cr标记，并调整YAC-1细胞浓度为2×106/ml。取0.5 ml细胞悬液用γ计数器测量放射性活性(cpm值)作为注射YAC-1细胞的总cpm值，每鼠经尾静脉注射0.5 ml，1小时后放血处死小鼠，完整取出肺、脾和肝，测量残存的cpm值，用YAC-1细胞的残存百分数表示体内NK活性水平，YAC-1细胞残存率越低，表明NK活性越高。

　　2.用整体腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法评价巨噬细胞功能［9］：实验前2小时腹腔注射0.2 ml 10%鸡红细胞，实验时取出小鼠腹腔液，用电动离心涂片机制片，经风干、固定、染色后，油镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬率(%)。

　　3.用鲁米诺依赖的酵母多糖刺激法测定WBC-CL［10］：每份样品分别测量基础化学发光(bCL)和激活化学发光(aCL)，用PBS缓冲体系，测量体积1 ml，bCL测量管含0.1 ml血和0.1 mmol/L鲁光诺，aCL测量管含0.1 ml血、0.1 mmol/L鲁米诺和0.1 mg/ml酵母多糖，于37℃测量10秒发光计数，间隔180秒测量一次，连续测量1小时，结果以103个WBC的发光强度(cps/103 WBC)表示。

　　4.用溶血空斑法(小室法)测定PFC［11］：小鼠腹腔注射0.2 ml 10%绵羊红细胞免疫5天后，取脾脏制成单细胞悬液，计数细胞数，将脾细胞与补体(豚鼠血清)一起于37℃孵育1小时后，计数溶血空斑数，结果用IgM/106脾细胞表示。

　　5.用足跖厚度增加法测定DTH［12］：小鼠腹腔注射0.2 ml 10%绵羊红细胞免疫4天后，在左足跖部皮下注射20 μl 20%绵羊红细胞，右足跖部皮下注射20 μl生理盐水。次日(20～24小时后)测量左右足跖厚度，用两足跖厚度差值(mm)表示DTH。

　　六、数据处理

　　实验数据表示为均数±标准差。用t检验比较各组间均数差异的显著性。结果

　　一、NNK对小鼠免疫功能的影响

　　注射NNK后小鼠免疫功能的变化见表1～7。表1结果表明，与未注射NNK的NC组相比，脾NK活性在注射NNK后1～3天出现应激性增高(YAC-1细胞残存率下降)，7天降低(YAC-1细胞残存率增高)，14天恢复到NC组的水平，但在观察的2周内未发现注射NNK后小鼠肺、肝组织NK活性有明显变化表1　NNK对小鼠部分器官中NK活性的影响(±s) 组别器官注射NNK不同时间后YAC-1细胞残存率(%) 1d 3d 7d 14d NC 肺 26.8±6.9(11) 28.0±11.5(5) 30.5±12.6(5) 27.0±5.8(6) 　脾 2.9±0.2(11) 3.1±0.2(5) 3.0±0.3(5) 2.9±0.3(6) 　肝 20.2±1.5(11) 18.1±1.1(5) 18.1±1.0(5) 19.4±1.6(6) NNK 肺 27.9±4.6(8) 28.1±1.6(6) 29.5±4.4(6) 27.8±4.0(6) 　脾 2.5±0.1**(8) 2.4±0.2**(6) 3.5±0.4*(6) 2.8±0.5(6) 　肝 18.2±0.8(8) 17.9±2.2(5) 17.6±3.0(6) 18.5±1.5(6)

　　括号内为样本数；与NC比，*P<0.05，**P<0.001 表2　NNK对小鼠脾NK活性的影响和茶的保护效果(±s) 组别 YAC-1细胞残存率(%) 3d 7d 14d NC 3.1±0.2(5) 3.0±0.3(5) 2.9±0.3(6) NNK 2.4±0.2(6)*** 3.5±0.4(6)* 2.8±0.5(6) NNK+GT 2.0±0.3(6)***# 2.3±0.4(6)**## 2.5±0.3(6)* NNK+MT 1.9±0.4(6)***# 2.2±0.6(6)*## 2.6±0.2(6)* NNK+TP 2.4±0.3(6)*** 2.1±0.4(6)***### 2.3±0.3(6)**#

　　括号内为样本数，与NC比，*P<0.05，**P<0.01，　***P<0.001；与NNK比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 表3　NNK对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响和茶的保护效果(±s) 组别吞噬率(%) 3d 7d 14d 28d NC 23.6±5.1(6) 21.4±4.5(5) 20.3±2.1(5) 18.0±5.7(6) NNK 45.0±3.4(6)*** 15.2±3.9(5)* 20.2±2.9(4) 18.5±5.7(6) NNK+　GT 30.8±4.5(5)*### 21.6±4.3(5)# 26.3±5.6(5) 19.0±4.7(6) NNK+　MT 27.4±5.9(6)### 23.7±6.0(6)# 24.0±6.1(4) 19.2±3.8(6) NNK+　TP 34.8±5.4(5)**## 21.5±4.4(5)# 25.2±4.6(5) 20.7±4.9(6)

　　与NC比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与NNK比，　#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 表4　NNK对小鼠外周血WBC-bCL的影响和茶的保护效果(±s) 组别动物数(只) bCL(cps/103WBC) 3d 7d 14d 28d NC 6 11.4±2.5 12.3±5.3 10.9±4.6 9.3±5.9 NNK 6 4.1±1.2*** 4.1±1.7** 6.1±2.5* 7.2±3.1 NNK+　GT 6 5.4±0.6*** 10.3±3.6## 6.7±1.6 8.3±4.2 NNK+　MT 6 6.7±1.8**## 9.8±2.8## 7.1±3.7 7.5±4.9 NNK+　TP 6 7.4±2.7*## 10.3±2.8## 8.2±2.9 9.0±3.7

　　与NC比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与NNK比，##P<0.01

　　从表3～7中可以看出，腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力与脾NK活性的变化一致，即在注射 表5　NNK对小鼠外周血WBC-aCL的影响和茶的保护效果(±s) 组别动物数(只) aCL(cps/103WBC) 3d 7d 14d 28d NC 6 16.2±3.4 18.7±8.1 14.8±7.1 20.6±10.9 NNK 6 29.0±6.0*** 30.4±9.3* 32.1±17.6* 29.3±21.3 NNK+　GT 6 24.9±6.2** 19.6±4.2# 15.8±11.2 21.7±14.6 NNK+　MT 6 23.0±3.8** 21.1±8.2# 17.3±8.1 20.7±11.4 NNK+　TP 6 22.3±4.0**# 21.2±6.3# 10.6±4.1# 18.6±9.5

　　与NC比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与NNK比，　#P<0.05 表6　NNK对小鼠脾抗生成细胞数的影响和茶的保护效果(±s) 组别动物数(只) 抗体生成细胞数(IgM/106脾细胞) 3d 7d 14d 28d NC 6 699±103 784±225 623±161 646±132 NNK 6 425±149** 550±123* 545±128 565±119 NNK+　GT 6 772±302# 1 042±329## 676±205 591±96 NNK+　MT 6 605±122# 838±255# 759±243 637±128 NNK+　TP 6 856±160### 907±297# 663±293 659±250

　　与NC比，*P<0.05，**P<0.01；与NNK比，#P<0.05，　##P<0.01，###P<0.001 表7　NNK对小鼠迟发性变态反应的影响和茶的保护效果(±s) 组别动物数(只) 迟发性变态反应(mm) 3d 7d 14d 28d NC 6 0.58±0.13 0.54±0.11 0.52±0.16 0.51±0.17 NNK 6 0.48±0.19 0.31±0.08** 0.34±0.10* 0.52±0.13 NNK+　GT 6 0.52±0.14 0.62±0.17## 0.66±0.20## 0.68±0.14 NNK+　MT 6 0.59±0.08# 0.63±0.16## 0.47±0.13 0.59±0.12 NNK+　TP 6 0.73±0.19# 0.59±0.10## 0.75±0.25## 0.65±0.10

　　与NC比，*P<0.05，**P<0.01；与NNK比，#P<0.05，　##P<0.01

　　NNK后3天明显增高，7天下降，以后恢复到NC组水平(表3)。外周血白细胞基础化学发光(WBC-bCL)在注射NNK后明显降低(表4)，而酵母多糖刺激诱发的外周血白细胞化学发光(WBC-aCL)显著增高(表5)，随注射NNK后时间的延长，bCL和aCL异常变化虽有所恢复，但较缓慢，28天仍未完全达到NC组水平(表4，5)。脾PFC在NNK注射后3天明显降低，7天有所恢复，14天达到接近NC组水平(表6)。DTH在注射NNK后3天开始下降，7～14天降低尤为显著，此后逐渐恢复，28天达到NC组相同水平(表7)。

　　综上结果可以看出，NNK可引起小鼠多种免疫功能的改变，且各种指标出现抑制或增高的变化和程度也不尽相同。

　　二、茶及其成分对NNK所致小鼠免疫功能改变的保护

　　注射NNK的小鼠分别饮用1.0% GT、0.5% MT和0.5% TP，观察茶及其成分对NNK所致小鼠免疫功能改变的保护效果，结果见表2～7。从表2结果看出，各保护组脾NK活性均比NC组明显增高，表现在脾YAC-1细胞残存率显著降低，提示茶及其成分对小鼠脾NK活性可能有增高作用。从对NNK所致小鼠脾NK活性改变的保护效果来看，NNK+GT和NNK+MT组在NNK注射后3～7天保护效果明显，而NNK+TP在NNK注射后7～14天有明显保护效果，提示GT和MT在该调节机制方面可能相似，而与TP的调节机制可能在时相上存在差异。

　　表3结果表明，各保护组对NNK所致小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能早期的应激性增高(3天)和随后的降低(7天)均有明显保护效果，其中NNK+MT组在注射NNK后的3天恢复到NC组水平，NNK+GT和NNK+TP组也分别在注射NNK后的7天恢复到NC组水平。

　　茶及其成分对NNK所致小鼠外周血WBC-CL异常改变的保护效果见表4和表5。可以看出，在注射NNK后的早期(3天)，1.0% GT对bCL的保护效果尚不明显，而0.5% MT和0.5% TP有一定保护效果；1.0% GT和0.5% MT对aCL的保护效果在NNK注射后早期(3天)均不明显，只有0.5% TP有一定保护效果，这可能与三种茶制剂的有效成分含量方面存在差异相关。但三种茶制剂在NNK注射后7天对小鼠WBC-CL的异常改变均有明显的保护效果，并完全恢复到NC组水平。

　　表6和表7结果表明，三种茶制剂在注射NNK后3天对NNK所致小鼠脾PFC和DTH的不良改变有明显的保护效果，结果均恢复到与NC组相当的水平。

　　综上所述，1.0%绿茶、0.5%复合茶和0.5%茶多酚对NNK所致小鼠免疫功能的异常改变，包括非特异免疫，体液免疫和细胞免疫，以及NK活性，均有明显的保护效果。 讨论

　　烟草及其烟雾中的有害成分对动物免疫系统的损伤是多方面的，并与吸烟致癌或诱发其他疾病相关联［13］。至今尚未见到有关烟草特异亚硝胺对动物免疫功能损伤的报道。本研究采用一次注射致癌剂量的NNK诱发小鼠免疫功能损伤的实验模型，观察到NNK引起多种免疫功能发生异常改变。其中，脾NK活性(细胞毒功能)和腹腔巨噬细胞吞噬功能(非特异免疫)出现双相性改变，即早期的应激性增高(注射NNK后3天)和随后的降低(注射NNK后7天)，而脾抗细胞生成数(体液免疫)和迟发型变态反应(细胞免疫)均出现抑制性降低。相对而言，同样是反应非特异免疫功能的外周血白细胞化学发光的变化程度较重，且持续时间长，4周尚未完全恢复到正常对照组水平，其他免疫指标的变化程度相对较轻，分别在注射NNK后2周或4周完全恢复。提示NNK不仅对不同的免疫功能有不同的影响，而且所致免疫功能损伤的程度和时相也不同，其原因和机制有待进一步研究阐明。值得一提的是，虽然NNK为亲肺性致癌物，并在肝内进行代谢活化，但我们在观察的时间内并未发现肺、肝中NK活性的改变，这可能是由于NNK的致癌为远期效应，通常要在注射NNK后的数月才会出现癌变［14］。这些器官内NK活性的改变很可能出现在NNK注射后较晚的时期，并可能与肿瘤的发生直接相关，是否如此还有待进一步研究证实。

　　本研究以NNK诱发小鼠多种免疫功能改变的实验模型，观察绿茶、复合茶和茶多酚的免疫调节作用。结果表明，三种茶制剂对NNK所致小鼠免疫功能的异常改变均有较好的保护效果。值得指出的是：三种茶制剂对NNK所致小鼠免疫功能异常的调节作用因免疫指标而异，具有双向调节作用。对外周血白细胞化学发光、脾抗体生成细胞数及迟发性变态反应的异常改变的调节作用是随时间延长而逐渐恢复到正常对照水平的；而对NNK所致腹腔巨噬细胞吞噬功能和脾NK活性的异常增高或降低均能恢复到正常对照水平。作者单位：1 军事医学科学院放射医学研究所　北京市　100850，2 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所参考文献　1　Preston-Martin S. Evaluation of the evidence that tobacco-specific N-nitrosamine (TSNA) cause cancer in humans. Crit Rev Toxicol, 1991,21：291-297.　2　Djordjevic MV, Brunnemann KD, Hoffmann D. Identification and analysis of a nicotine-derived N-nitosamino acid and other nitrosamino acids in tobcco. Carcinogenesis, 1989,10：1725-1733.　3　Hoffmann D, Rivenson A, Chung FL, et al. Nicotine-derived N-nitrosamines (TSNA) and their relevance in tobacco carcinogenesis. Crit Rev Toxicol, 1991,21：305-311.　4　Hecht SS, Hoffmann D. Tobacco-specific nitosamines, an important group of carcinogens in tobacco and tobacco smoke. Carcinogenesis, 1988,9：875-884.　5　Morse MA, LaGreca SD, Amin SC, et al. Effects of indole-3-carbinol on lung tumorigenesis and DNA methylation induced by 4-（methylnitrosamino-)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) and on the metabolism and disposition of NNK in A/J mice. Cancer Res, 1990,50：2613-2617.　6　童小麟.儿茶素的理化性质.生物学作用及其开发应用研究进展.茶叶通讯，1989，4：37-41.　7　朱茂祥，龚诒芬，陈君石，等.绿茶对小鼠Lewis肺癌生长的抑制及免疫调节.中华预防医学杂志，1997，31：325-329.　8　谢克平，姚立人，史敏言，等.天然杀伤细胞活性的测定：2.体内YAC-1细胞清除试验.上海免疫学杂志，1988，8：291-295.　9　王小京.几种阿片肽及AMT对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用.中国免疫学杂志，1987，3：211-214.10　朱茂祥，龚诒芬，葛桂秀，等.大鼠吞噬细胞释放的自由基在放射性肺炎发展中的作用.中华放射医学与防护杂志，1996，16：96-99.11　Jene NK, Nordin AA. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science, 1963,140：405-410.12　薛彬，雷志明.T淋巴细胞功能检测.见：薛彬主编.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社，1995.北京.27-28.13　Johnson JD, Houchens DP, Kluwe WW, et al. Effects of mainstream and environmental tobacco smoke on the immune system in animals and human. Crit Rev Toxicol, 1990,20：369-375.14　Hecht SS, Morse MA, Amin S, et al. Rapid single-dose model for lung tumor induced in A/J mice by 4-(methylnitrosamino-)-1-(3-pyridyl)-1-butanone and the effect of diet. Carcinogenesis, 1989,10：1901-1904.