次比较，确认其为RuBP羧化酶大、小亚基。由图1可见，白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平，复绿后急剧升高，两个亚基的变化幅度基本相近。
因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园，已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照，为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关，而不是叶片本身发育的原因，选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照，对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别。种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示。根椐电泳图谱的对比，也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异，但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化，与白茶复绿期水平接近，大大高于白茶返白期水平。该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致，说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：复绿中期；FG：全复绿期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 1　安吉白茶突变体返白过程不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.1　SDS-PAGE scanning profiles of soluble leaf proteins during Anjibaicha albescent progress

EA：相当于白茶返白初期； FA：相当于白茶全白时期；FG：相当于白茶全复绿时期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: The same time to early albescent stage; FA: The same time to fully albescent stage;FG: The same time to fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 2　安吉白茶有性后代不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.2　SDS-PAGE scanning profiles of the soluble leaf proteins of Anjibaicha seedling progenies

2.2　返白过程中RuBP羧化酶的活性变化
为进一步确证RuBP羧化酶在返白与复绿过程中的变化，采用同位素方法测定了白茶突变体返白过程各时期RuBP羧化酶的活性。其结果(图3)表明该酶活性在返白初期即较低，随叶片返白程度的加深又略有下降，然后又随叶片的逐步复绿而渐渐升高，其变化趋势与返白过程中叶绿素的变化完全一致。这一结果不仅与叶片可溶性蛋白的电泳结果一致，也和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的解体与恢复现象〔3〕一致，说明安吉白茶在返白期叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏，而在复绿期又得到了重建。

EA：返白初期；FA：全白期；SG：复绿初期； HG：复绿中期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; SG: Slightly green stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 3　安吉白茶不同返白复绿阶段RuBP羧化酶活性的变化
Fig.3　Variation of RuBPcase activity at the different albescent stages of Anjibaicha

2.3　返白过程中蛋白酶的变化
RuBP羧化酶大、小亚基含量的同时下降提示我们需对蛋白的降解作一分析，为此测定了白茶突变体返白与复绿各阶段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量。其结果(图4)表明，与随后的复绿阶段相比，返白期蛋白水解酶活性总体较高，可溶性蛋白含量较低，两者有较好的负相关性；而总游离氨基酸明显积累，其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。而复绿后蛋白水解酶活性逐步降低；与此对应，可溶性蛋白含量随复绿过程逐步升高，同时游离氨基酸含量下降，游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。因此安吉白茶在返白阶段游离氨基酸库容的增大，很可能是由于蛋白酶活性的增大，导致了蛋白质的大量水解引起。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：半复绿期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 4　安吉白茶不同返白复绿阶段可溶性蛋白,游离氨基酸和蛋白酶活性变化
Fig.4　Variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of Anjibaicha

3　讨论

RuBP羧化酶是一种重要的叶蛋白，几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右，催化光合作用中CO2的固定。安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的，与返白过程中蛋白酶活性的变化呈负相关关系。许多学者认为，RuBP羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物，因此造成RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化期下降的原因，很可能是由于突变诱发的蛋白酶活性升高导致了RuBP羧化酶蛋白的大量水解。因此，蛋白酶活性在白化期的显著上升是安吉白茶白化期氨基酸总量增加的直接原因。
高等植物的RuBP羧化酶是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物，其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码，而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。在水稻中，由叶绿体基因组缺失所导致的花培白化苗，其RuBP羧化酶大亚基水平极低而小亚基较为正常〔5〕，而核基因突变产生的水稻白绿苗〔5〕，则两个亚基同时受到影响。安吉白茶在其返白与复绿过程中，RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升，与水稻白绿苗的情形较为类似。且其种子后代中只有少量种子苗能够保持返白特征，因此安吉白茶的返白突变不可能是仅仅由于质体基因组突变产生。

*国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目。
作者单位：李素芳　陈　明　虞富莲　成　浩　中国农业科学院茶叶研究所，杭州　310008

参考文献

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2　 成　浩，李素芳. 安吉白茶阶段性返白突变的气候调控因子. 中国青年农业科学学术年报. 北京：中国农业出版社，1997, (A卷):572～577
3　 李素芳，陈树尧，成　浩. 茶树阶段性返白现象的研究——叶绿体超微结构的变化. 茶叶科学. 1995, 15(1):23～26
4　 王维光，李立人．菠菜二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶简化提纯研究．植物生理学报．1980，6(3)：257～261
5　 杨　炜，钱　前，黄大年. 水稻白绿苗可转化性与核酮糖1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶小亚基的关系. 科学通报. 1982, 20:1897～1900
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8　 Laemmli U K. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, 227:680～685
9　 Amane Makino, Tadahiko Mae, Koji Ohira. Purification and storage of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from rice leaves. Plant & Cell Physiol. 1983, 24(6):1169～1173