蛋白酶活性较高，可溶性蛋白含量降低，是造成游离氨基酸总量明显积累的直接原因。
关键词　安吉白茶；阶段性返白；温敏突变体；蛋白酶； RuBP羧化酶

Studies on the Stage Albescent Phenomenon in Tea
——the Changes of RuBPcase and Proteinase

Li Sufang　Chen Ming　Yu Fulian　Cheng Hao
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou　310008)

Abstract　The variation of large and small subunits of RuBPcase from temperature-sensitive mutant of Anjibaicha (Camellia sinensis) during its stage albescent process was investigated as well as the changes of the enzyme activities. The relationship between the levels of the RuBPcase subunits and the activities of proteinase was also discussed. It was found the levels of both large and small subunits were low at the albescent stage and became normal after leaves recovered to green, which corresponded with the enzyme activity change. Meanwhile, the high activity of protease and the lowering of leaf soluble protein content. At the albescent stage were the direct reasons for the accumulation of free amino acids.
Key words　Anjibaicha；Stage albescent mutation；Temperature sensitive mutant；Proteinase； RuBPcase

我们业已报道了温敏叶色突变体安吉白茶在返白过程中伴随着叶片色素含量的可逆性变化，其茶多酚含量、氨基酸含量与组成等都有对应的相关变化〔1，2〕，尤其是返白阶段的氨基酸总量比对照品种高出许多，使以此突变体为原料制作的成品茶滋味较为鲜爽；不仅如此，在返白与复绿过程中还有叶绿体数量分布和叶绿体超微结构〔3〕的可逆性变化。但以安吉白茶无性系群体所产的种子进行繁殖的有性后代在白化性状上出现了分离，大多数种子后代不再具有返白特征，只有少量种子苗能保持其返白现象。本文主要探讨了在安吉白茶返白与复绿过程中，叶片RuBP羧化酶和蛋白酶的变化情况。

1　材料与方法

1.1　试验材料
种植在杭州中国农业科学院茶叶研究所苗圃和浙江省安吉县林科所白茶基地的无性系安吉白茶茶苗。并采用种植于本所苗圃的安吉白茶部分实生绿苗作为可溶性蛋白组分分析的对照材料。
1.2　试验方法
1.2.1　叶片可溶性蛋白组分分析
1.2.1.1　叶片可溶性蛋白提取　白茶和对照样各500mg，液氮冻干。加3.5ml可溶性蛋白提取液(30mmol／L Tris-HCl，pH 8.7；1mmol／L DTT；1mmol／L EDTA；5mmol／L MgCl2)、0.1g水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨。4℃，8640r／min离心10min。取200μl，加1ml冷丙酮（内含10mmol／L巯基乙醇），摇匀后置于-20℃冰箱1h，用TGL-16离心机10000r／min离心5 min，收集沉淀，减压干燥，-20℃保存备用。
1.2.1.2　可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕　浓缩胶浓度3%，分离胶浓度12%，含0.1%SDS。电泳后，凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h，然后用7%乙酸和15%甲醇脱色。胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描。分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u)，胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u)。
1.2.1.3　可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定　可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕，在岛津UV-265分光光度计上测吸光值，并计算蛋白浓度。蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕。游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87。
1.2.2　RuBP羧化酶提取及酶活力测定
1.2.2.1　RuBP羧化酶提取〔4,9〕　鲜叶去叶脉，液氮冷冻24h，再保存于-30℃冰柜待用。取10g上述保存的材料，加入80ml预冷的新鲜提取液（50mmol／L磷酸缓冲液，pH7.4，内含1mmol／L EDTA，5mmol／L巯基乙醇，10%甘油)，及2g水不溶性PVP，预冷的组织捣碎机匀浆，快速5s，慢速5s，重复3次。然后经4层预冷纱布过滤，滤液经11900r／min离心20min，收集上清。
1.2.2.2　RuBP羧化酶活力测定　采用同位素方法测定。总体积为800μl的反应混合液含100μmol Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，10μmol MgCl2，8μmol NaH14CO2 (2μCi)，2μmol DTT和100μl上述提取的RuBPcase酶液。25℃预温10min使酶活化，加入0.5μmol RuBP使反应开始。5min后，加入800μl HCl终止反应,90℃烘箱干燥。PACKARD 1900CA双道液体闪烁计数器测定，按以下公式计算酶活力：
U=DPM×3.997×60×V／(2.22×106×5×10-1)(CO2μmol.g-1.h-1FW)
式中：3.997为每微居里(μCi)14C相当于CO2的微摩尔数(μmol)；60为分钟数(min)；V为每克鲜重植物得到的酶液原液的体积(ml)；2.22×106为每分钟内1μCi14C的蜕变数；5为反应时间(min)；10-1为反应体积中酶液的体积(ml)。

2　结果与分析

2.1　叶片可溶性蛋白的电泳分析
叶片可溶性蛋白组分测定材料为本所苗圃3年生茶苗，自4月9日起每隔一周取样至5月16日叶片复绿时止。各时期样品电泳后进行比较，未能发现有明显的组分变化，仅发现有两条带的强度在不同时期有显著差异。将电泳胶片在薄层扫描仪上扫描后，其结果(图1)证实这两条带的含量在白化期与复绿后差异较大。根椐与低分子量标准蛋白质的对比计算，确定它们的分子量分别为54.2ku和14.9ku左右。经与菠菜RuBP羧化酶提纯品的多次比较，确认其为RuBP羧化酶大、小亚基。由图1可见，白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平，复绿后急剧升高，两个亚基的变化幅度基本相近。
因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园，已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照，为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关，而不是叶片本身发育的原因，选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照，对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别。种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示。根椐电泳图谱的对比，也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异，但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化，与白茶复绿期水平接近，大大高于白茶返白期水平。该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致，说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：复绿中期；FG：全复绿期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 1　安吉白茶突变体返白过程不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.1　SDS-PAGE scanning profiles of soluble leaf proteins during Anjibaicha albescent progress

EA：相当于白茶返白初期； FA：相当于白茶全白时期；FG：相当于白茶全复绿时期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基
EA: The same time to early albescent stage; FA: The same time to fully albescent stage;FG: The same time to fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase
图 2　安吉白茶有性后代不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图
Fig.2　SDS-PAGE scanning profiles of the soluble leaf proteins of Anjibaicha seedling progenies

2.2　返白过程中RuBP羧化酶的活性变化
为进一步确证RuBP羧化酶在返白与复绿过程中的变化，采用同位素方法测定了白茶突变体返白过程各时期RuBP羧化酶的活性。其结果(图3)表明该酶活性在返白初期即较低，随叶片返白程度的加深又略有下降，然后又随叶片的逐步复绿而渐渐升高，其变化趋势与返白过程中叶绿素的变化完全一致。这一结果不仅与叶片可溶性蛋白的电泳结果一致，也和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的解体与恢复现象〔3〕一致，说明安吉白茶在返白期叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏，而在复绿期又得到了重建。

EA：返白初期；FA：全白期；SG：复绿初期； HG：复绿中期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; SG: Slightly green stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 3　安吉白茶不同返白复绿阶段RuBP羧化酶活性的变化
Fig.3　Variation of RuBPcase activity at the different albescent stages of Anjibaicha

2.3　返白过程中蛋白酶的变化
RuBP羧化酶大、小亚基含量的同时下降提示我们需对蛋白的降解作一分析，为此测定了白茶突变体返白与复绿各阶段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量。其结果(图4)表明，与随后的复绿阶段相比，返白期蛋白水解酶活性总体较高，可溶性蛋白含量较低，两者有较好的负相关性；而总游离氨基酸明显积累，其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。而复绿后蛋白水解酶活性逐步降低；与此对应，可溶性蛋白含量随复绿过程逐步升高，同时游离氨基酸含量下降，游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。因此安吉白茶在返白阶段游离氨基酸库容的增大，很可能是由于蛋白酶活性的增大，导致了蛋白质的大量水解引起。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：半复绿期；FG：全复绿期
EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage
图 4　安吉白茶不同返白复绿阶段可溶性蛋白,游离氨基酸和蛋白酶活性变化
Fig.4　Variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of Anjibaicha

3　讨论

RuBP羧化酶是一种重要的叶蛋白，几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右，催化光合作用中CO2的固定。安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的，与返白过程中蛋白酶活性的变化呈负相关关系。许多学者认为，RuBP羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物，因此造成RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化期下降的原因，很可能是由于突变诱发的蛋白酶活性升高导致了RuBP羧化酶蛋白的大量水解。因此，蛋白酶活性在白化期的显著上升是安吉白茶白化期氨基酸总量增加的直接原因。
高等植物的RuBP羧化酶是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物，其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码，而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。在水稻中，由叶绿体基因组缺失所导致的花培白化苗，其RuBP羧化酶大亚基水平极低而小亚基较为正常〔5〕，而核基因突变产生的水稻白绿苗〔5〕，则两个亚基同时受到影响。安吉白茶在其返白与复绿过程中，RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升，与水稻白绿苗的情形较为类似。且其种子后代中只有少量种子苗能够保持返白特征，因此安吉白茶的返白突变不可能是仅仅由于质体基因组突变产生。

*国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目。
作者单位：李素芳　陈　明　虞富莲　成　浩　中国农业科学院茶叶研究所，杭州　310008

参考文献

1　 李素芳，成　浩，虞富莲，晏　静. 安吉白茶阶段性返白过程中氨基酸的变化. 茶叶科学. 1996, 16(2):153～154
2　 成　浩，李素芳. 安吉白茶阶段性返白突变的气候调控因子. 中国青年农业科学学术年报. 北京：中国农业出版社，1997, (A卷):572～577
3　 李素芳，陈树尧，成　浩. 茶树阶段性返白现象的研究——叶绿体超微结构的变化. 茶叶科学. 1995, 15(1):23～26
4　 王维光，李立人．菠菜二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶简化提纯研究．植物生理学报．1980，6(3)：257～261
5　 杨　炜，钱　前，黄大年. 水稻白绿苗可转化性与核酮糖1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶小亚基的关系. 科学通报. 1982, 20:1897～1900
6　 吴如月. 溶液中蛋白质浓度的测定.蛋白质和酶学研究方法(第一册).鲁子贤主编. 北京：科学出版社， 1989：5～7
7　 X H 波钦诺克著. 荆家海，丁钟荣译. 植物生物化学分析方法. 北京:科学出版社，1981: 221～224
8　 Laemmli U K. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, 227:680～685
9　 Amane Makino, Tadahiko Mae, Koji Ohira. Purification and storage of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from rice leaves. Plant & Cell Physiol. 1983, 24(6):1169～1173