茶树阶段性返白现象的研究—RuBP羧化酶与蛋白酶的变化*
发布时间 2009-07-11 浏览 34593 次
。4℃,8640r/min离心10min。取200μl,加1ml冷丙酮(内含10mmol/L巯基乙醇),摇匀后置于-20℃冰箱1h,用TGL-16离心机10000r/min离心5 min,收集沉淀,减压干燥,-20℃保存备用。1.2.1.2 可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕 浓缩胶浓度3%,分离胶浓度12%,含0.1%SDS。电泳后,凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h,然后用7%乙酸和15%甲醇脱色。胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描。分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u),胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u)。1.2.1.3 可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕,在岛津UV-265分光光度计上测吸光值,并计算蛋白浓度。蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕。游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87。1.2.2 RuBP羧化酶提取及酶活力测定1.2.2.1 RuBP羧化酶提取〔4,9〕 鲜叶去叶脉,液氮冷冻24h,再保存于-30℃冰柜
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